Pendant longtemps, les causes réelles de son décès ont fait l'objet de beaucoup de spéculations et de théories, la présence d'une blessure au bas du crâne laissant planer le doute d'un assassinat. Mais les analyses les plus récentes ont révélé que non seulement il souffrait d'une maladie congénitale provoquant une affection osseuse, mais qu'en plus il avait une forme grave de paludisme, l'association des deux maladies pouvant avoir été fatale.
Des traces de drépanocytose, une maladie héréditaire qui se caractérise par la détérioration de l'hémoglobine, ont été également trouvées. Le roi avait aussi une déformation osseuse des pieds et une fracture de l'os de la cuisse gauche, provenant peut-être d'un accident de chasse ou d'un accident de char. La présence de cannes et d'une boite à pharmacie dans sa tombe confirme ce diagnostic, et indique qu'il était équipé pour combattre sa maladie dans l'au-delà.
Si les causes exactes du décès vont sans doute encore faire l'objet de débats pointus entre spécialistes, on peut avancer désormais que, à force de liaisons incestueuses depuis plusieurs générations de Thoutmosides, le jeune roi avait hérité de nombreuses tares génétiques accumulées par ses ancêtres. Cette défaillance explique aussi sans doute pourquoi il n'a pas eu de descendants, comme en témoignent les deux petites momies de fillettes mort-nées découvertes dans sa tombe. Les tests ADN ont permis de confirmer la paternité de Toutankhamon.
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